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αSMA+肌成纤维细胞中I型胶原缺失增强免疫抑制

发布时间 2021-07-24 23:06

  I型胶原(Col1)是人体内含量最丰富的蛋白质,Col1基本功能单元是由两条a1链和一条a2链组成的螺旋三聚体,三聚体棒状分子相互作用形成原纤维,并进一步交联形成大纤维束。在胚胎发育过程中,许多器官表达Col1以促进细胞迁移、分化和结构区划,已有研究表明与肿瘤组织相关的Col1在癌细胞周围产生一个生物物理上“僵硬”的微环境,通过Col1纤维“轨道”促进细胞迁移,并促进异常的细胞相互作用以诱导癌细胞的增殖和存活。

  在胰腺导管腺癌(PDAC)中,Col1是肿瘤间质/微环境的主要组成部分,与PDAC相关的α-平滑肌肌动蛋白阳性(Alpha-smooth muscle actin, α-SMA+)肌成纤维细胞(激活的胰腺卫星细胞)被推测对Col1的产生有重要贡献,并被认为可以阻碍药物向癌细胞的传递、限制T细胞的浸润;此外,近来研究表明,PDAC中的间质成纤维细胞可能在不同条件下发挥不同功能,促进或抑制肿瘤发展。然而,Col1在PDAC的发生和发展中的确切功能尚不明确。

  目前PDAC的基因工程小鼠模型在阐明PDAC的分子和病理机制方面具有重要价值,然而,无法从基因上操纵间质细胞中的基因仍然是这些遗传模型的一个局限。整合使用了Cre-loxP和FLP-FRT系统的双重组酶系统(DRS)小鼠的独特优势在于能够特异敲除某种细胞类型的基因。

  研究首先验证了双重组酶系统小鼠模型发生自发性胰腺癌,并存在进行基质细胞特异性基因操作的可能性。研究使用Flp-FRT系统、Cre-loxP系统分别诱导了两个Kras表达且p53丢失的小鼠家系(KPPF小鼠和KPPC小鼠),将两个家系结合,并利用双同源重组报告系统,研究者用EGFP和tdTomato分别标记了Pdx1谱系的癌细胞和α-SMA阳性的肌成纤维细胞,并观察到随着疾病进展,Col1在胰腺组织中的沉积量逐渐增加。此外,作者对KPPF小鼠胰腺肿瘤的活细胞混合物进行了单细胞转录组分析,再次验证了成纤维细胞是KPPF小鼠Col1的主要贡献者。

  为了测试肌肉成纤维细胞产生的Col1在胰腺癌中的功能,研究在小鼠模型中分别特异性敲除了αSMA+肌成纤维细胞(KPPF;Col1smaKO小鼠)、Fsp1+基质细胞中的Col1。αSMA+肌成纤维细胞中Col1缺失的小鼠没有明显的表型改变,但PDAC组织中纤维状Col1、结缔组织增生相关标志物和生物物理硬度的总体水平降低;此外,αSMA+肌成纤维细胞中Col1的缺失显著降低了小鼠的总生存率并加速了PDAC进展。相反,敲除Fsp1+基质细胞中的Col1对小鼠PDAC进展、Col1沉积和总生存率影响并不明显,这一结果表明,虽然一些Fsp1+成纤维细胞可能产生Col1,但它们对PDAC间质中Col1总含量的贡献并不决定PDAC的进展速率,抑或是其他细胞的补偿使这一效应并不明显。Figure 3

  为了探索αSMA+肌成纤维细胞中Col1缺失影响PDAC进展的机制,研究从基质细胞组成、肿瘤细胞表型、免疫细胞亚群等角度进行了分析。KPPF;Col1smaKO小鼠和KPPF小鼠的肿瘤单细胞转录组测序结果表明,成纤维细胞、内皮细胞、粒细胞和癌细胞等几种细胞群的细胞数量和亚群分布基本相似,且癌细胞的亚群分布和表达特征也相似。有趣的是,KPPF;Col1smaKO小鼠肿瘤中髓系细胞、T细胞和B细胞的特征明显改变,髓系细胞根据基因表达聚类成两个不同的亚群(Myeloid-1和Myeloid-2),且Myeloid-2亚群与肿瘤相关的巨噬细胞和相关的髓系来源的抑制细胞(MDSCs)具有共同的分子特征(CD206+ F4/80+ Arg1+),KPPF;Col1smaKO肿瘤表现为Myeloid-2亚群增多,T、B淋巴细胞减少,髓系细胞/T细胞比例增加。免疫组化染色和流式细胞术进一步证实了这一结果。Figure 4

  此前研究表明,CD206+ F4/80+ Arg1+的髓系细胞亚群可能通过精氨酸酶-1、白介素-18抑制T和B淋巴细胞功能,研究通过组织块转录组测序技术分析了募集髓系细胞的细胞因子和趋化因子,结果显示Cxcl5和其他一些SOX9靶基因在KPPF;Col1smaKO肿瘤中的表达显著增加,CXCL5是一种有效的MDSC趋化剂,且受到SOX9调控;免疫组化证实,SOX9+癌细胞的百分比在KPPF;Col1smaKO小鼠的晚期PDAC和KF;Col1smaKO小鼠的早期PanIN/PDAC中均增加。为了研究胞外基质与SOX9的关系,研究在KPPF;Col1smaKO肿瘤中建立原代PDAC细胞系,用不同浓度的纯化Col1处理,结果表明Col1处理降低Sox9和Cxcl5的表达水平,且存在剂量依赖;此外,TCGA中PDAC队列的转录组数据表明SOX9的表达与COL1A1负相关。为了研究CCL2和CXCL5对MDSCs的募集和对肿瘤进展加速的作用,研究使用针对CXCL5-CXCR2轴和CCL2-CCR2轴的抑制剂治疗KPPF和KPPF;Col1smaKO小鼠,CXCL5-CXCR2和CCL2-CCR2轴的抑制剂组合显著提高了KPPF;Col1smaKO小鼠的存活率,使其恢复到与对照组KPPF小鼠相似的水平。这些结果表明,KPPF;Col1smaKO肿瘤细胞中COL1含量的降低可以上调Sox9和Cxcl5的表达,可能有助于MDSCs的募集,也可能加速肿瘤进展。Figure 6

  最后,研究进一步探索了αSMA+肌成纤维细胞中Col1缺失对T、B淋巴细胞招募和激活的影响。单细胞转录组测序结果表明,KPPF;Col1smaKO肿瘤中的T和B淋巴细胞不仅细胞总数减少,且与淋巴细胞招募和激活相关的多种关键基因的表达也受到显著抑制;进一步利用TSA多光谱成像研究人PDAC样本,观察到Col1水平与CD8+T细胞、CD4+T细胞、CD4+FoxP3-效应细胞等T细胞亚群呈正相关,但与CD4+FoxP3+调节性T细胞(Tregs)无关;高COL1组也表现出淋巴结转移少、长期生存率高的趋势。这些结果表明,PDAC中Col1缺乏与T、B淋巴细胞的减少和肿瘤的加速进展存在相关性。Figure 7

  细胞外基质(Extracellular matrix, ECM)的组成、组织和硬度影响细胞粘附依赖的细胞骨架张力,从而调节组织结构,因此是组织稳态的关键调节器。在癌症研究中,ECM已经越来越多地被认为是肿瘤微环境(TME)的重要组成部分,且可能存在促进恶性转化和调节肿瘤侵袭的功能[1]。ECM 在PDAC发病机制中至关重要[2],I型胶原(Col1)已经被许多研究人员报道为PDAC基质中沉积的细胞外基质(ECM)的重要组成部分,本研究采用双重组酶系统小鼠模型揭示了COL1在自发PDAC中的功能,肌成纤维细胞产生的Col1在PDAC的总Col1含量中起重要作用,且肌成纤维细胞中Col1的缺失与MDSCs数量的增加、T/B淋巴细胞的减少和抑制相关。本研究为了解PDAC微环境提供了新的见解,也提出了潜在的治疗干预靶点。

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