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完全性脊髓损伤再生机制的探讨

发布时间 2020-07-19 21:59

  脊髓损伤后,因脊髓组织受损会导致损伤节段以下部分或完全性的感觉及运动功能缺失。由外部物理撞击导致的创伤性脊髓损伤,伤后早期主要表现为严重的脊髓组织损伤及神经细胞死亡,之后会引发严重的继发性损伤,如局部缺血、炎症、大量神经元和少突胶质细胞死亡、胶质瘢痕以及囊性空洞形成等。近年研究发现,成年哺乳动物创伤性脊髓损伤后的原发及继发性损伤会逐渐改变损伤部位的细胞组成及组织结构,最终在损伤部位形成一个阻止轴突再生的抑制微环境。此外,除了抑制微环境形成外,成年神经元的内在生长潜力较差也是导致脊髓自发再生可能性低的重要因素,最终导致永久性神经缺损。但有研究发现,通过调节神经细胞的内在生长潜力或移除脊髓损伤微环境中的某些抑制因素(单一或组合),一些成年神经元和轴突仍具有一定再生能力。

  虽然脊髓损伤不会显著影响患者寿命,但可能导致患者生理和心理问题,高昂的治疗费用也会给患者家庭及社会带来沉重负担。目前,脊髓损伤的临床治疗仍集中在稳定病变组织结构,防止对邻近脊髓组织的进一步损害,以及通过康复提高患者生活自理能力,尚缺少有效促进神经再生和功能恢复的治疗方案,而完全性脊髓损伤的修复被认为是临床研究中最具挑战性的问题之一。

  近年,动物实验研究已为创伤性脊髓损伤的治疗提供了一些新的概念和可行方案,并显示出临床转化潜力。我们团队在近20年的脊髓损伤再生修复研究中,成功建立了哺乳动物脊髓大段缺损完全损伤模型,包括啮齿类、犬及非人灵长类模型,在临床研究中也取得了突破性进展。现对神经再生胶原支架移植治疗完全性脊髓损伤动物实验研究的成果,以及通过引导内源性神经元形成桥接改善运动功能的相关研究进展进行总结,并探讨完全性脊髓损伤动物中运动功能改善的机制,旨在为下一步完全性脊髓损伤的相关研究提供参考。

  近年用于脊髓损伤修复基础研究及治疗评价的创伤性脊髓损伤动物模型较多,包括挫伤、挤压伤、横切及化学损伤等不同致伤因素制备的模型。与上述创伤性脊髓损伤模型相比,完全性脊髓损伤模型完全排除了轴突芽生的可能性,可以真实反映轴突再生情况,为研究轴突再生提供了最理想的平台。目前,许多研究人员将完全性脊髓损伤动物模型作为检验神经再生的金标准。与啮齿类动物模型相比,大动物(如犬)模型在损伤症状、不良预后和康复训练等方面与临床患者更相似,近十年间完全性脊髓损伤模型从啮齿动物到大动物逐渐得到改进和完善。但是,由于轴突纤维和脊髓神经元的缺失,完全性脊髓损伤模型制备后实验动物会出现永久性瘫痪以及一系列继发性并发症,如褥疮、骨质疏松、深静脉血栓、尿路感染、肌肉痉挛和呼吸并发症等,因此术后护理要求极高,提高了该类模型使用的难度。在完全性脊髓损伤模型修复研究过程中,我们团队建立了大鼠3~6mm缺损的全横断急性及陈旧性脊髓损伤模型,通过自主研发的神经再生胶原支架结合再生因子或生物拮抗分子、人MSCs、神经干细胞等进行修复,治疗后大鼠运动功能均不同程度恢复。我们还率先建立了犬5mm~2CM急性及陈旧性脊髓损伤模型,通过6批次近300只犬的实验,证实神经再生胶原支架结合神经再生因子或生物拮抗分子、人MSCs可有效促进损伤部位神经再生及犬运动功能的恢复。

  此外,我们还成功制备了恒河猴T9长段(6mm)急性全横断脊髓损伤模型,并通过此模型验证了神经再生胶原支架复合生长因子NT3在神经损伤修复中的作用。术后10个月,与空白对照组以及单纯支架材料组相比,实验组恒河猴运动诱发电位以及后肢运动功能明显改善,损伤区内的胶质瘢痕沉积明显减少,而且可见更多的有序神经纤维再生、轴突髓鞘化以及突触形成。

  随着生物材料领域的发展,许多生物支架也应用于各种类型脊髓损伤修复,部分生物支架显示出了一定的临床应用潜力。研究表明,功能生物支架移植可促使损伤部位产生运动神经元,包括五羟色胺能(5-HT阳性)、乙酰胆碱能(chAT阳性)、多巴胺能(TH阳性)神经元。这表明基于功能修饰的生物材料治疗方案可以有效促进脊髓损伤部位的神经再生,恢复运动功能。

  在脊髓损伤修复中使用的生物支架大多是由重复单元组成的天然聚合物,其具有容易获得、抗原性低、生物相容性好和可降解等优势。一种理想的修复脊髓损伤的生物支架需要具备以下性质:①生物支架能为受损的轴突和神经元的重新生长和迁移提供结构上的支持;②生物支架具有可调节的生化特性,与脊髓组织机械特性相匹配,而且能够引导神经元及轴突的生长及迁移;③生物支架应易于使用某些具有生物活性的多肽或蛋白因子进行修饰或功能化,实现特定的修复效果;④移植入体内的生物支架可以在适当时间内降解,被再生神经组织所替代;⑤生物支架及其降解产物无细胞毒性且免疫原性低。我们团队在近20年的研究中,设计研发了一系列神经再生胶原支架,将其移植至损伤造成的缺口时能起到连接两断端的作用。这些功能修饰后的神经再生胶原支架不仅能在脊髓横断或瘢痕切除后起到物理连接的作用,而且还可以引导内源性神经干细胞分化,促进组织再生及运动功能恢复。特定的生长因子对组织再生修复具有促进作用。为了实现结合在功能胶原生物支架上的生长因子能长时间缓释,我们构建了胶原结合肽(CBD)修饰的生长因子BDNF(CBD-BDNF),与神经再生胶原支架结合治疗完全性脊髓损伤比格犬(实验组),观察发现治疗38周后,与空白对照组相比,实验组胶质瘢痕明显减少,而且大量神经纤维可以长入损伤区域,超过40%的犬在26~38周可以站立甚至行走。

  由于完全性脊髓损伤后激活的神经干细胞表达EGF受体(EGFR),因此我们利用临床药物西妥昔单抗(一种EGFR的抗体)与神经再生胶原支架共同孵育,并将修饰后支架移植至大鼠全横断脊髓损伤模型的损伤部位。损伤后15d,可见内源激活的神经干细胞在损伤部位富集和分化。而在犬全横断脊髓损伤模型中,移植西妥昔单抗修饰功能生物材料9个月后,可以部分恢复运动诱发电位反应,显著改善后肢的运动功能。

  为了进一步实现结合在胶原支架上的西妥昔单抗长时间缓释,我们构建了特异性结合EGFR抗体的神经再生胶原支架。我们选取了EGFR抗体西妥昔单抗蛋白上的功能单元Fab,结合一段CBD,成功构建CBD-Fab表达载体。在确认修饰后的蛋白生物活性保持不变后,我们将CBD-Fab修饰的神经再生胶原支架移植入完全性脊髓损伤大鼠中。结果表明,该支架可以通过与神经干细胞表面EGFR结合,特异性吸附神经干细胞,促进其在损伤部位存留及向神经元分化,同时还可以降低胶质瘢痕的沉积,改善大鼠运动功能。而且,将该神经再生胶原支架与外源性神经干细胞一同移植入完全性脊髓损伤大鼠的损伤区,体外移植及体内损伤激活的神经干细胞均会被特异性吸附并存留在支架上,且外源及内源神经干细胞均能分化为神经元。

  除了西妥昔单抗及其功能单元外,我们近期研究还证实载有抗癌药物紫杉醇的神经再生胶原支架能够有效促进犬长距离脊髓全横断损伤后的轴突再生、神经元再生、电生理和运动功能恢复。此外,将人MSCs及外源神经干细胞复合胶原神经再生支架进行移植,同样可以促进大鼠及犬的神经纤维再生、轴突髓鞘化以及突触形成,经过治疗的比格犬可以用瘫痪的后肢站立甚至行走。

  在临床前研究的基础上,我们于2015年1月16日首次开展了神经再生胶原支架移植治疗完全性脊髓损伤的临床研究。在前期5例患者中,首次采用术中电生理等手段鉴定神经组织和瘢痕组织,并实施了对瘢痕组织的安全清除,同时进行神经再生胶原支架的移植。经过1年的随访,结果表明神经再生胶原支架移植治疗脊髓损伤安全可行。随后的研究表明,神经再生胶原支架结合MSCs可以促进部分陈旧性完全性脊髓损伤患者植物神经功能改善、感觉平面下降以及手指的运动功能改善等。在急性脊髓损伤临床研究中,建立了综合ASIA评分、影像学和电生理等的严格急性完全性脊髓损伤判定标准,目前已入组10余例急性脊髓损伤患者,部分入组患者出现较准确的大小便感觉,下肢出现自主的运动功能恢复,并伴随有中断的感觉诱发电位和运动诱发电位的恢复。综上所述,经过因子、拮抗剂修饰或复合干细胞的神经再生胶原支架可以有效促进神经再生,实现全横断损伤啮齿动物及犬的运动功能恢复。

  鉴于完全性脊髓损伤模型在轴突再生验证研究中的有效作用,近年来已有越来越多的研究人员运用这种完全性脊髓损伤,尤其是应用胸段完全性脊髓损伤模型(可以完全截断下肢的上行及下行神经传导)来研究神经再生及下肢运动功能的恢复。这些研究使用了很多单一或者组合的治疗策略,如生长因子、生物活性拮抗剂或多肽、临床用药、外源细胞移植,以及功能性生物支架移植,这些治疗策略对完全性脊髓损伤动物的神经再生或运动功能恢复均有不同程度的作用,也对脊髓损伤后功能恢复的机制进行了初步探讨。目前研究认为完全性脊髓损伤运动功能恢复机制有3种可能的理论,分别为长的运动轴突再生穿过损伤区,损伤区神经元形成桥接连接损伤的两个断端,或者两者兼具。

  运动神经轴突再生理论研究表明,损伤区的抑制微环境阻碍了轴突再次生长,在无有效干预下,切断的轴突不太可能自发延伸甚至穿过损伤区,更不可能与它原定的或新的靶向神经元形成连接。因此,一些研究人员尝试通过改善完全性横断后的微环境来促进运动功能的恢复,如通过外周神经搭桥、细胞移植、生物工程方法构建基质或支架等。

  在完全性脊髓损伤动物治疗研究中,在损伤部位常能检测到再生的运动性轴突,主要包括组成皮质脊髓束(CST)、缝核脊髓束、网状脊髓束和红核脊髓束的轴突。这些调节运动功能的下行神经纤维束对改善动物的运动功能非常重要。其中,CST由于在自主性运动功能恢复中的关键作用备受关注。许多研究者认为,在严重脊髓损伤后,CST的再生可能是恢复前肢和后肢运动功能的方法。

  回顾分析近十年来完全性脊髓损伤动物轴突再生及运动功能恢复的研究,我们发现超过一半的研究通过不同的治疗策略显著改善了完全性脊髓损伤动物的运动功能,常用方法包括人工构建神经支架或基质移植修复,同时还可以结合药物、蛋白因子、各种外源性细胞(如雪旺细胞、嗅神经鞘胶质细胞、神经干细胞、MSCs、少突胶质前体细胞、骨髓基质细胞)以及其他替代物。这些研究均表明,某些截断的轴突在损伤后会继续生长,包括五羟色胺能、乙酰胆碱能及多巴胺能的轴突。但是,这些研究中几乎都没能发现完全性截断后的脊髓中有CST轴突延伸或穿过损伤区。早期研究结果表明,只有将大鼠胚胎期脊髓移植至大鼠全横断损伤模型的损伤部位,才有可能支持CST轴突的再生。在近期的一项研究中,Kadoya等将从胚胎期14d的大鼠脊髓原基中分离获得的神经前体细胞移植入T3段完全截断的大鼠模型中,发现部分CST轴突可以再生,最长达1.5mm。除了胚胎期脊髓移植外,Yang等将壳聚糖材料复合神经营养因子NT3移植至完全性横断脊髓大鼠损伤区,发现治疗1个月后小部分CST纤维可以从头端长入损伤区域,穿过5mm长的损伤区域,进入大鼠尾椎脊髓。但是,CST纤维的这种再生仍需要通过标记技术得到更准确的结果,以验证其可信度和可重复性。

  在对CST轴突再生或芽生的研究中,人们发现了许多抑制或促进因素。在抑制信号通路中研究最多的是Nogo介导的抑制信号通路以及雷帕霉素靶蛋白mTOR的抑制因子磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)。但是,这些研究使用的模型并非完全性横断脊髓损伤,而是挤压伤或背侧半横切损伤。在CST轴突再生的研究中,即使是脊髓完全性挤压伤模型中,仍有可能存在残留的CST轴突,其结果也备受争议。即使不考虑模型类型及CST能否再生,CST轴突的再生或芽生与运动功能恢复间的关系同样难以定论。Jin等的研究发现,条件性敲除感觉运动皮层中细胞因子激活通路的抑制因子SOCS3,可以促进未损伤的CST轴突向去神经化的脊髓中芽生。此外,如果同时敲除PTEN,CST轴突芽生的数量及训练后的运动功能恢复程度都会显著提高。同时,Geoffroy等也发现PTEN及PTEN/Nogo敲除的小鼠中,虽然CST轴突的芽生明显增强,但小鼠功能恢复并不明显。上述研究报道结果中运动功能恢复的差异可能与不同基因敲除小鼠的运动功能恢复程度不同,以及CST轴突的芽生数量及其与尾端靶向神经元的成功连接与否有关,但也使学者们对啮齿动物中CST在运动功能中的作用提出了质疑。

  目前,研究发现了越来越多可以促进CST轴突芽生或再生的蛋白因子,如肝配蛋白B3及其受体EphA4、Krüppel样因子7、信号转导及转录激活因子3、传统型蛋白激酶C、转录因子Sox11及mTOR的靶蛋白核糖体S6激酶1。虽然这些研究都表明在非完全性脊髓损伤的啮齿动物中CST轴突可以延伸穿过损伤区,但由于模型的局限性,这些结论都很难证实是否是截断的CST轴突的再生。因此,仍需在完全性横断的脊髓损伤模型中证实是否存在与运动功能相关的CST轴突的再生。迄今为止,最新的关于CST再生的综述为2012年由Tuszynski及Steward发表的。有一些研究认为观察到CST再生的现象缺乏时间及可重复性的检验。因此,在完全性脊髓损伤动物中通过脊髓移植或人工构建支架移植使CST纤维再生缺乏足够的文献证实。

  综上所述,对于脊髓损伤后CST轴突的生长,已有的研究大多认为其主要是通过残存的完整的神经纤维芽生来实现功能恢复;而即使是有部分横断的CST生长,其再生距离和数量也非常有限,迄今尚缺乏客观研究证实全横断后运动轴突(如CST轴突)可以再生穿过损伤缺口实现运动功能恢复。由目前的研究结果来看,通过CST轴突长距离再生实现完全性脊髓损伤动物的运动功能恢复的可行性仍未可知。

  内源性神经桥接理论在全横断脊髓损伤的啮齿动物及犬模型中,很多治疗方案都可以显著改善动物模型运动功能。由于全横断后运动轴突(如CST轴突)再生机制至今仍未明确,有些学者提出在重新连接截断的脊髓束并恢复运动功能中起重要作用的并非运动轴突再生,而是外源或内源神经元分化形成桥接,连接损伤的两个断端。移植或内源的神经干细胞可以定向分化成多种神经元,在损伤部位形成神经桥接,促使新的突触连接,形成环路,改善脊髓损伤后动物的运动功能。基于这种理论,外源神经干细胞/神经前体细胞近年来被广泛应用于脊髓损伤的治疗。在动物实验中,外源神经干细胞/神经前体细胞移植后可分化为神经细胞,补充损伤部位缺失的神经元及营养因子,重新形成神经桥接,促进运动功能的恢复。

  但是,外源神经干细胞/神经前体细胞移植应用于临床还面临巨大的挑战。首先,除存在的伦理问题外,从人的胚胎组织中获得的神经前体细胞仍存在成瘤的风险;其次,由于成人自体神经前体细胞很难获得,接受同种异体神经前体细胞移植的患者必须通过免疫抑制来减弱免疫排斥反应;再次,成人神经前体细胞的体外扩增目前还非常困难,使得临床上很难获得足够量的细胞进行移植。最后,移植用神经前体细胞最合适的来源、数量,给药途径及移植的方式目前都不清楚。因此,我们重点关注人工构建的神经再生胶原支架引导内源神经干细胞发挥作用,来改善啮齿动物和犬的运动功能的进展。

  内源神经干细胞来源许多研究已证明,位于成体脊髓中央管中的室管膜细胞具有神经干细胞样潜能。这些细胞在正常组织中并不活动,但在损伤后的脊髓组织中会被激活并迁移至损伤部位。在脑缺血或中风后,脑组织中的神经干细胞会分化为神经元,并替代受损的神经元,修复神经连接。但是,被激活的室管膜细胞在损伤后4周内倾向于分化为胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)阴性(未成熟的)的星形胶质细胞(占所有星形胶质细胞的53%),并未分化为神经元。其余47%由幼稚星形胶质细胞分化的GFAP阳性(成熟的)的星形胶质细胞会积聚在损伤区中央,并形成密集的胶质瘢痕,这是小鼠受伤2周后轴突再生的主要障碍。

  近年来,研究认为巢蛋白(nestin)/脑脂质结合蛋白(BLBP)阳性的神经干细胞存在于中央管及正常脊髓中,据此我们在T8段脊髓全横断损伤的大鼠模型中发现了体内脊髓来源的神经干细胞的激活时间轴。损伤发生后,nestin阳性的神经干细胞在损伤脊髓的邻近节段中大量聚集,在第5天达高峰,并随着离损伤部位的距离增加而逐渐减少。此外,中央管及脊髓中的神经干细胞与室管膜细胞的特征有所区别,中央管中由损伤激活的神经干细胞可被常规的神经干细胞标记物nestin和BLBP所标记,但却不能被干细胞的标记物Sox2标记,而中央管中的室管膜细胞可以被这3种标记物同时标记。Yang等及我们近期研究均表明,脊髓完全性截断后,小部分nestin阳性的神经干细胞会自发分化为神经元,这种分化效率会随着药物的使用而提高。上述研究结果提示,如果经过适当的引导,内源神经干细胞可能相比室管膜细胞更有可能成为治疗完全性脊髓损伤的一种细胞来源。

  神经再生胶原支架作用通过啮齿动物及犬的全横断脊髓损伤模型进行大量脊髓损伤再生修复研究后,我们发现虽然神经再生胶原支架很难在脊髓完全性横断后促进运动轴突的再生,但研究结果均支持完全性脊髓损伤后运动功能恢复机制中的第2种理论,即经过功能性修饰后的神经再生胶原支架可以引导内源性神经干细胞分化,形成神经桥接,重新连接损伤的两个断端,实现完全性横断的脊髓损伤动物的运动功能改善。

  在将小鼠T8段脊髓完全截断5d后,大部分被激活的神经干细胞会聚集在邻近损伤部位的脊髓组织中,而只有很少一部分出现在损伤区中心。这是由于完全性横断会造成脊髓组织中一定长度缺口,如果缺乏适合的引导,被损伤激活的神经干细胞就无法迁移。在利用神经再生胶原支架结合西妥昔单抗治疗完全性脊髓损伤大鼠的研究中,在损伤后15d,虽然不同治疗组损伤部位的头端及尾端都观察到相似数量的神经干细胞,但功能修饰的神经再生胶原支架移植组与单纯神经再生胶原支架移植组相比,损伤中心部位神经干细胞的密度明显更高。我们近期的一系列研究表明,被损伤激活的神经干细胞不会自发地迁移至损伤部位,而经过适当修饰的功能支架可以在适当的时间释放和分布生物活性因子,引导内源神经干细胞的迁移路线。

  除了在大鼠完全性脊髓损伤模型中证明了特定修饰的神经再生胶原支架可以促进内源损伤激活的神经干细胞在损伤部位富集及分化外,我们研究还证实了大动物(犬)的完全性脊髓损伤模型中同样存在神经发生。在移植后9个月,我们在损伤部位同样观察到了更多成熟的神经元,而且这些神经元可以在损伤部位发育为具有髓鞘化轴突及突触结构的各种功能神经元,如五羟色胺能、乙酰胆碱能及多巴胺能神经元。基于以上研究结果,我们提出了功能修饰的神经再生胶原支架可以引导损伤激活的神经干细胞分化为神经元,形成神经桥接,连接损伤的两个断端,进而促进运动功能恢复的理论。

  综上述,相关研究提示在完全性脊髓损伤动物模型中,尚缺少客观充分证据证实运动轴突,尤其是CST轴突可以再生。因此,3种完全性脊髓损伤运动功能恢复的可能机制中,只有第2种内源神经桥接机制更可行(图1)。成功引导内源脊髓神经干细胞迁移至损伤部位只是完全性脊髓损伤后形成新的神经桥接并恢复运动功能的第一步,这些迁移至损伤部位的神经干细胞及其子代如何才能向神经元分化、成熟并形成新的功能连接,是接下来需要考虑和解决的问题。

  大量研究表明,仅阻断细胞外抑制因素促进受伤轴突或长脊髓束再生无明显效果,在神经元中可能存在重要细胞和分子机制来控制轴突再生。目前报道的组合治疗策略中,尚无一种能很好地在全横断脊髓损伤动物中促进运动轴突(如CST)长距离生长并穿过损伤区。由于CST轴突是控制人体自主运动功能最重要的运动轴突,可能必须有足够的CST纤维再生穿过损伤区,并与原定的尾端靶向神经元精确联接,才能显著地促进运动功能的恢复。

  因此,引导内源神经干细胞的再生可能是除了CST轴突再生之外更为可行的恢复运动功能的策略。虽然严重的脊髓损伤使大量的神经元丢失、神经回路被扰乱、运动功能严重受损,但也同时激活了处于静息状态的内源脊髓神经干细胞。如果能够引导这些神经干细胞及其子代迁移至损伤部位,它们就会为神经功能重建提供充足的细胞来源。因此,损伤激活的内源神经干细胞是一种潜在的治疗细胞源。然而,将这种方法用于临床尚有大量问题需要解决。成体动物脊髓损伤后,内源脊髓神经干细胞(包括室管膜细胞)已被证实可以被损伤激活并大量扩增,但尚无研究报道导致脊髓神经干细胞激活和向损伤区边缘迁移的原因或诱导因素,相关机制也未明确。此外,不同内源神经干细胞的分化能力及分化特性可能也存在差异。成年室管膜细胞在体外培养时会表现出类似神经干细胞的特性,具有多能性,可分化为星形胶质细胞、少突胶质细胞及神经元,但体内的室管膜细胞在脊髓损伤后并不能分化为神经元,而且我们的研究也发现,与有定向神经元分化能力的神经干细胞相比,室管膜细胞在体内表现出非常不同的分化特性。完全性脊髓损伤后修复的主要目的是重建受损的神经环路。因此,明确损伤后激活的内源性脊髓神经干细胞的分化能力和特性,以及影响不同细胞向神经元分化的因子和信号通路对于形成神经元桥接、连接损伤断端来说是亟待解决的问题。将修饰后的功能神经胶原支架移植入损伤部位,构建适合神经元分化的微环境,可以有效引导损伤激活的神经干细胞分化形成更多的神经元及少突胶质细胞,进而促进损伤部位的神经再生、髓鞘化,重建损伤部位的神经桥接。

  即使在损伤部位有足够的神经再生、轴突髓鞘化,形成充足的神经桥接,有时运动功能的恢复也不如预期。如Lu等的研究发现,在大鼠T3全横断脊髓损伤的亚急性期,通过移植过表达BDNF大鼠MSCs后可以观察到损伤部位神经桥接及突触的形成,但运动功能反而变得更差。事实上,一些关于促进轴突再生的研究也表明,CST再生也直接导致了运动功能恶化。这种神经桥接的形成与运动功能恶化之间矛盾的原因可能是由于再生的轴突未能与下游靶向神经元形成正确的突触连接造成的。因此,如何在重建神经桥接中促进新生轴突与下游靶向神经元间形成正确而有效的连接,是今后设计全横断脊髓损伤治疗方案时必须要考虑的重要问题。

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